同种异体脱细胞真皮替代同种异体巩膜在眼窝填充中的实验研究
发布时间:[2011-09-28]
中华整形外科杂志 2005 年5月第21卷第3期
同种异体脱细胞真皮替代同种异体巩膜
在眼窝填充中的实验研究
陈涛,闵燕,李冬梅,赵颖,何玉良
【摘要】
目 的:①了解同种异体脱细胞真皮植入兔眼窝后的组织相容性。②比较两种不同材料包裹羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)植入的结果,包裹材料及HA的血管化进程。
方 法:随机将24只新西兰大白兔平均分为两组,于球后间隙内分别植入以同种异体巩膜、同种异体脱细胞真皮作为包裹材料的HA,观察大体情况并分别于植入后1、4、8、12周取出,光镜及电镜检查组织学改变。
结 果:大体显示同种异体脱细胞真皮组植入后无一例出现排斥,但其血管化速度较同种异体巩膜组缓慢。
结 论:同种异体脱细胞真皮作为包裹材料有较好的组织相容性,并能逐渐引导被包裹材料的血管化。
关键词 脱细胞异体真皮;异体巩膜;眼窝填充
目前临床上填充眼窝应用最多的羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA包裹材料是同种异体巩膜)(下简称巩膜),但巩膜来源有限,不能成为产品批量生产,有些医院甚至没有来源。我们应用同种异体脱细胞真皮(下简称脱细胞真皮)与巩膜分别植入家兔眼窝中,观察大体的和组织学方面变化以及比较被包裹的HA血管化的进程。
一、材料与方法
1. 实验动物:健康纯种新西兰白兔24只,体重2.5~3.5kg,雌雄不限,动物来源于中国药品生物制品检定所,动物等级为二级。
2. 实验材料:HA包裹材料,包括新西兰白兔脱细胞真皮(北京桀亚莱福生物技术有限责任公司提供)及新西兰白兔巩膜(北京同仁眼库制备)。材料大小为20.0mm×10.0mm×0.5mm。置入HA材料大小50mm×50mm×50mm,孔隙率60%,孔径大小500μm。
中华整形外科杂志 2005 年5月第21卷第3期
3. 实验过程:实验分为1、4、8、12周共4个时间点,每1时间点各取1个标本共3只动物。复方氯胺酮注射液静脉注射20mg/kg全身麻醉,0.5%地卡因结膜囊表面麻醉。一律选动物右眼,开睑器开睑,庆大霉素溶液冲洗结膜囊。作鼻上象限角膜缘结膜切口,长度为1/4象限。沿巩膜表面分离至球后,将包裹材料包裹固定于HA表面,自切口沿分离的间隙置入球后。结膜以6-0可吸收缝线间断缝合。术毕全身应用庆大霉素2万U每天1次,连续用3d。结膜囊滴庆大霉素眼药水,每天3次。观察动物的进食活动情况,伤口愈合情况,眼球有无不良反应,置入物是否移动、脱出,伤口有无裂开。
4. 标本制备:于术后1、4、8、12周将动物处死后立即取材。首先观察兔眼结膜有无充血,有无破溃,置入物有无脱出移位。将置入体(HA及包裹材料)一并取出,测量大小后,将所有标本送组织学光镜检查。1、4、12周标本送电镜检查,电镜标本为1mm×1mm×1mm。
二、结果
1. 一般观察:所有动物都在术后2h内清醒,无不良反应。术后1周内术侧眼球略显突出,结膜轻度充血,无分泌物及破溃,1周后眼球突度恢复正常(图1),结膜充血渐消退,伤口一期愈合,缝线自行脱落。所有置入材料无移位、无脱出。两种包裹材料与术前相比,无明显吸收变薄,面积保持不变。除1周取材时见脱细胞真皮与HA连接疏松外,其它时间点包裹材料均与HA粘贴紧密。
2. 光镜组织学检查:
2.1 巩膜组:第1周:大体见巩膜与HA已有明显粘连,用齿镊可将之与HA分开;光镜下见巩膜内有散在淋巴细胞、浆细胞,并见少量巨噬细胞。近巩膜侧HA部分孔隙已可见新生结缔组织,并有成纤维细胞增殖及少量新生血管图2()。第4周:大体见巩膜与HA愈着紧密,与周围软组织亦有紧密附着。光镜下见HA孔隙中已充满纤维结缔组织,内含大量新生毛细血管。巩膜内淋巴细胞和浆细胞较第1周已明显减少。第8周:光镜下见HA中心已有新生肉芽组织充填,新生血管丰富。第12周:大体见巩膜与HA愈着紧密,用齿镊难以分开;光镜下HA中心纤维结缔组织状况同第8周(图3)。
2.2 脱细胞真皮组:第1周:大体见真皮与HA粘连疏松,极易分离;光镜下真皮组织内也可见淋巴细胞及浆细胞浸润,但HA孔隙中无新生纤维组织长入(图4)。第4周:大体见真皮与HA已愈着,但用齿镊能将其分开;光镜下见部分
中华整形外科杂志 2005 年5月第21卷第3期
HA孔隙已见新生疏松纤维结缔组织,也有新生血管长入。第8周:脱细胞真皮与HA已愈着,难以分开;光镜下见HA孔隙中已被纤维结缔组织充满,新生血管数量增多。第12周:光镜下见纤维结缔组织中充满新生毛细血管,单从HA中心的新生组织状况已难区分两组有无差异(图5)。
3. 电镜检查:两种包裹材料分别于1、4、12周送扫描电镜及透射电镜检查。
3.1 巩膜组:第1周即可见成纤维细胞及新生血管。第4周及12周成纤维细胞增殖活跃,新生血管增多。
3.2 脱细胞真皮组:第4周始见成纤维细胞及新生血管,以后成纤维细胞增生活跃,还可见有吞噬HA颗粒的异物巨细胞(图6)。
三、讨 论
HA材料表面粗糙,临床应用中习惯在填充时于其表面包裹一层材料或组织[1,2],作为包裹材料需要其具备有良好的张力、韧性、可塑性、低抗原性和良好的组织相容性。随着眼部整形手术的迅速发展,HA材料填充时的包裹材料也趋于多样化。人工合成材料:聚羟基乙酸、聚乙醇酸等材料已被应用于临床[3,4]。自体组织材料:临床上已尝试应用阔筋膜、自体真皮、耳后肌、腹直肌鞘等[5-9]。同种异体材料:作为包裹材料的同种异体组织中有巩膜、硬脑膜、肌腱。其中异体巩膜在临床实践中应用最多[3,4,10]。异种生物材料:牛心包及猪巩膜。牛心包作为HA的包裹材料已被多位国外学者在临床应用,所得的结果也不尽相同[11,12]。猪巩膜作为包裹材料仅存在于动物实验阶段,国内外均尚未见公开报道[13]。
尽管巩膜是公认的较好的包裹材料但其来源受限,不能满足临床需要,另外巩膜多为医院自行制备,没有经过严格的检疫及消毒,其安全性正在受到质疑,特别是通过PCR检查发现艾滋病患者的巩膜在经过无水乙醇或高温处理后仍有HIV-1病毒的基因表达,从而不免令人担心巩膜存在传播其他潜在传染病的危险,在国外已有部分患者因此拒绝巩膜移植[14]。
能否找到一种巩膜的替代材料一直是临床实践探讨的内容,这种材料既要具备巩膜的优点,又需来源丰富。脱细胞真皮采用组织工程学技术,运用化学方法及生物学方法脱去真皮中各种细胞使病毒等微生物丧失了赖以寄生的场所,保留细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)制备而成,而以胶原为主要成分构成的ECM是一种结构非常稳定的惰性物质,除起着支持、连接细胞的作用外,还为细胞的生长、代谢提供场所,并起重要的调节作用[15]。体外实验显示该材料可以很好地支持宿主上皮组织在其表面生长。ECM框架抗原性低,种属差异小,将其作为宿主细胞生长的载体,最初应用于治疗全层皮肤烧伤,在移植后2周组织学观察显示炎症反应存在,随移植时间的延长,炎症反应逐渐消失,胶原排列整齐,尤为突出的是它具有完整的基底膜,可引导细胞新生和扩展,促进自体成纤维细胞在异体真皮支架中生长,促进创面的愈合[16]。而且从同一供体取材所能得到的真皮数量要远远大于巩膜的数量,这样可以有效降低成本。脱细胞真皮已由专门的生产厂家制备生产,也有特殊的检疫消毒程序,过去主要应用于烧伤整形外科,目前已扩展到口腔科及眼科临床应用。
通过我们短期的动物实验观察发现,脱细胞真皮由于富含弹力纤维结缔组织,纤维间致密而缺乏空隙,在置入早期,脱细胞真皮的血管化进程较巩膜缓慢,在置入1周时,巩膜组HA边缘孔隙中已经可以见到新生血管及纤维结缔组织,而脱细胞真皮组还没有反应。在置入后4周脱细胞真皮组已开始有所反应,孔隙中已有纤维结缔组织充填。但在置入后8周,无论是巩膜组还是脱细胞真皮组的HA中心都已有纤维结缔组织及新生血管长入,二者已不易区分。置入后12周二者从组织切片上已基本相同。这说明脱细胞真皮虽然在移置后组织血管化进程上较我们熟悉的巩膜材料缓慢,但在置入中期已近似于甚至等同于巩膜的血管化程度,同时也能诱导被包裹的HA材料的进一步血管化。脱细胞真皮质地柔韧,可任意裁剪成不同形状及尺寸,适用于包裹不同大小的置入材料,其中光滑面为基底膜面。在作为HA的包裹材料时,可将真皮面朝外以利于置片的快速血管化。但由于实验证明脱细胞真皮在置入早期血管化进程较异体巩膜缓慢,因此在作为HA的包裹材料置入时要十分谨慎。当置入部位较深,血运较丰富的情况时,脱细胞真皮因其大小不受限制而较巩膜更具优越性。当然由于实验条件的限制脱细胞真皮作为包裹材料的远期效果还有待于进一步观察。
参 考 文 献
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(收稿日期:2004-06-24)